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WB实验中薄膜转移步骤的探讨

免疫印迹,也称为Western印迹,是基于抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的特定蛋白质的方法。
Westernblot是一种基于凝胶电泳和固相免疫分析开发的新型免疫化学技术。
由于SDS-PAGE的高分辨率和固相免疫测定的高特异性和灵敏性,Western印迹已成为蛋白质分析的常规技术。
Western印迹通常用于鉴定特定蛋白质并进行蛋白质的定性和半定量分析。
主要实验步骤如下:1。
蛋白质提取实验是组织样本,取适量(250-500毫克)新鲜或妥善储存的组织样本,加入1毫升总蛋白质提取试剂(或提取试剂)提取含有蛋白酶抑制剂的全蛋白(或核蛋白)并均质化。
实验对象是细胞样品,从每个样品中收集1×10 6至1×10 7个细胞,用PBS洗涤,并加入PBS加0。
含有总蛋白质蛋白酶(或核蛋白)抑制剂提取物的1 ml至1 ml总蛋白质提取试剂(或核蛋白提取试剂)。
2)
蛋白质定量:使用BCA蛋白质定量试剂盒说明书确定样品的浓度。
3)
变性聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺不连续凝胶(SDS-PAGE)电泳:分别加载制备的样品溶液和染色的蛋白质标记物,将标准品加入到*孔中,并通过电泳分离蛋白质。
4)
将蛋白质转移至PVDF膜,根据Bio-Rad蛋白质转移装置组装滤纸凝胶的中间纤维素层,并以4℃30mA的恒定流速转移过夜。
5)
将Western印迹膜块和抗体孵育膜与5%脱脂奶粉溶液在室温下孵育1小时以阻断非特异性膜结合。
将封闭的膜加入第一抗体中,在室温下孵育1。
5小时抗原 - 抗体结合。
加入HRP标记的双抗体以结合第一抗体,并将膜在室温下温育1小时。
通过添加HRP标记的GAPDH抗体,可以同时检测GAPDH含量。
6)
通过化学发光检测蛋白质印迹结果,并将膜与化学发光底物一起温育并暴露于X膜暴露。
图像扫描保存为计算机文件,使用GIS1000分析软件将图像中每个特定条带的伽马值数字化。
7)
Westernblot数据分析:将目标蛋白的灰度值除以内部GAPDH /肌动蛋白参考的灰度值以校正误差,结果代表样品中目标蛋白的相对含量。
8)
提供实验报告,详细的实验方法和免疫印迹实验结果的相关数据。


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